产品介绍
非洲猪瘟单抗制备实验进程
1、免疫时间计划表
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实验进程 |
日期 |
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初免 |
2021.03.26 |
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二免 |
2021.04.02 |
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三免 |
2021.04.09 |
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四免 |
2021.04.16 |
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融合 |
2021.04.19 |
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筛选 |
2021.04.26 |
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亚一筛选 |
2021.05.02 |
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亚二筛选 |
2021.05.08 |
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亚三筛选 |
2021.05.14 |
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腹水 |
2021.05.23 |
2、二免效价、抗体特异性
加入免疫抗体100µL /孔， 轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应20min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。再加入酶标物100µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应20min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。加入底物液A液50µL/孔，再加底物显色液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。
结果及结论见下表：
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Ag 500倍 |
Ag 1k倍 |
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1-Ab 500倍 |
4.71 |
4.28 |
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1-Ab 5k倍 |
3.58 |
3.12 |
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2-Ab 500倍 |
4.52 |
3.97 |
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2-Ab 5k倍 |
2.45 |
2.01 |
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结论 |
1、Ag包被浓度为3K倍。 |
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2、二免效价较高。 |
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3、筛选效价
3.1 筛选效价
加入酶标物50µL /孔， 再加入细胞上清50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。加入底物液A液50µL/孔，再加底物显色液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。结果见下图：
结论：共选62个阳性孔的细胞进行抗体特异性测定。
3.2 筛选抗体特异性
加入酶标物50µL /孔， 再加入细胞上清50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。加入底物液A液50µL/孔，再加底物显色液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。结果见下图：
结论：共选出14株效价高、抗体特异性好的细胞进行第一次亚克隆。
株号有：2C4 3B9 3D6 3F10 4D1 4F4 5D2
5D4 5D7 7D4 7D7 7C8 8G10 4F10
4、亚一筛选效价
加入酶标物50µL /孔， 再加入细胞上清50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。加入底物液A液50µL/孔，再加底物显色液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。
结论：共选出10株效价高的细胞进行第二次亚克隆。
株号有：2C4 3D6 3F10 4F4 5D2 5D4 5D7 7D4 8G10 4F10
5、亚二筛选效价
加入酶标物50µL /孔， 再加入细胞上清50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。加入底物液A液50µL/孔，再加底物显色液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。
结论：经显微镜观察，有四株细胞100%纯阳性（5D2 5D4 5D7 3F10）扩大并冻存； 有六株细胞细胞进行第三次亚克隆。
三次亚克隆株号有：2C4 3D6 4F4 7D4 8G10 4F10
6、亚三筛选效价
加入酶标物50µL /孔， 再加入细胞上清50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。加入底物液A液50µL/孔，再加底物显色液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。
结论：经显微镜观察，有四株细胞100%纯阳性（8G10 2C4 4F4 7D4 ）扩大并冻存；
4F10和3D6株细胞转阴性，扔之。
7.腹水效价
将筛选到的非洲猪瘟8株单抗，制备腹水并测腹水效价。
加入酶标物50µL /孔， 再加入稀释后的抗体50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。加入底物液A液50µL/孔，再加底物显色液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。
结果及结论见下表：
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细胞株 |
Ab-5w |
Ab-10W |
效价 |
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2C4 |
3.98 |
3.17 |
>10w |
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3F10 |
3.29 |
1.63 |
>10w |
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4F4 |
3.54 |
1.55 |
>10w |
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5D2 |
4.37 |
2.11 |
>10w |
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5D4 |
3.54 |
1.62 |
>10w |
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5D7 |
3.96 |
1.91 |
>10w |
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7D4 |
4.19 |
2.54 |
>10w |
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8G10 |
1.36 |
0.84 |
10w |
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结论 |
非洲猪瘟筛选到8株单克隆抗体，腹水效价10w以上。 |
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非洲猪瘟单抗配对初步测试
ASFV共8株Ab，各按生产条件标记1条金垫后测试结果
标记：1号.2C4 2号.3F10 3号.4F4 4号.5D2 5号.5D4 6号.7D4 7号.8G10 8号.混合 9号.兔多抗
划线：用9株Ab同时划9种T线，1/1稀释.稀释液是动物CB液
（一） 金垫标记：1-8号单抗；T线：兔多抗划线1:1（动物包被液稀释）；
最初先用 1-8号金条和兔多抗1：1 划线测试阳性病料（1:5，用2*样稀稀释，非处理样品垫），如图1，8-10分观察，结论：爬速过快，需要调整爬速。
结论如下表：
1-8号金条与兔多抗1：1 测试阳性结果
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1号金垫 |
2号金垫 |
3号金垫 |
4号金垫 |
5号金垫 |
6号金垫 |
7号金垫 |
8号金垫 |
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划线兔多抗1：1 |
+ |
+ |
+- |
+ |
++ |
- |
- |
+ |
继续优化实验方案，用 1-8号金条和兔多抗1：1 分别测试阳性病料（1:5，用1*样稀稀释，用滤血膜）和猪阴性血清（1:5，用1*样稀稀释），8-10分观察，分别如图3和图4
（二） 颠倒测试，金垫标记：9号兔多抗标记；T线：1，2，3,4,5,8号单抗1：1（动物包被液稀释）；
阳性见图6，阴性见图7。 结论1,2号抗体最好。
9号兔多抗标记金条与1，2，3,4,5,8号抗体划线测试阴阳性结果
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1号Ab划线 |
2号Ab划线 |
3号Ab划线 |
4号Ab划线 |
5号Ab划线 |
8号Ab划线 |
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兔多抗标记的金垫 |
阳性 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
阴性 |
+--- |
+--- |
+-- |
+- |
+- |
+- |
（三） 对摸索到的六株单抗进行交叉配对测试（1号.2C4 2号.3F10 3号.4F4 4号.5D2 5号.5D4 8号.混合）
（1）1号抗体标记金条，依次为2 3 4 5 8号抗体1：1划线，测试阳性（病料1:5稀释，用1*样稀），见图8.测试阴性（猪血清1:5，用1*样稀），结果见图9
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2号Ab划线 |
3号Ab划线 |
4号Ab划线 |
5号Ab划线 |
8号Ab划线 |
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1号抗体标记的金垫 |
阳性 |
+- |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
阴性 |
+-- |
+- |
+-- |
+-- |
+-- |
（2）2号抗体标记金条，依次为1 3 4 5 8号抗体1：1划线，测试阳性（病料1:5稀释，用1*样稀），见图10.测试阴性（猪血清1:5，用1*样稀），结果见图11
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1号Ab划线 |
3号Ab划线 |
4号Ab划线 |
5号Ab划线 |
8号Ab划线 |
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2号抗体标记的金垫 |
阳性 |
+ |
++ |
+ |
+ |
++ |
|
阴性 |
+-- |
+- |
+-- |
+-- |
+- |
（3）3号抗体标记金条，依次为1 2 4 5 8号抗体1：1划线，测试阳性（病料1:5稀释，用1*样稀），见图12.测试阴性（猪血清1:5，用1*样稀），结果见图13
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1号Ab划线 |
2号Ab划线 |
4号Ab划线 |
5号Ab划线 |
8号Ab划线 |
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3号抗体标记的金垫 |
阳性 |
+ |
+ |
++ |
+ |
++ |
|
阴性 |
+-- |
+-- |
+-- |
+-- |
+- |
（4）4号抗体标记金条，依次为1 2 3 5 8号抗体1：1划线，测试阳性（病料1:5稀释，用1*样稀），见图14.测试阴性（猪血清1:5，用1*样稀），结果见图15
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1号Ab划线 |
2号Ab划线 |
3号Ab划线 |
5号Ab划线 |
8号Ab划线 |
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4号抗体标记的金垫 |
阳性 |
+ |
+ |
++ |
+ |
+ |
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阴性 |
+- |
+-- |
+- |
+- |
+- |
（5）5号抗体标记金条，依次为1 2 3 4 8号抗体1：1划线，测试阳性（病料1:5稀释，用1*样稀），见图16.测试阴性（猪血清1:5，用1*样稀），结果见图17
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1号Ab划线 |
3号Ab划线 |
4号Ab划线 |
5号Ab划线 |
8号Ab划线 |
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2号抗体标记的金垫 |
阳性 |
+- |
++ |
+ |
+ |
++ |
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阴性 |
+-- |
+-- |
+- |
+-- |
+- |
（6）8号抗体标记金条，依次为1 2 3 4 5号抗体1：1划线，测试阳性（病料1:5稀释，用1*样稀），见图18.测试阴性（猪血清1:5，用1*样稀），结果见图19
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1号Ab划线 |
2号Ab划线 |
3号Ab划线 |
4号Ab划线 |
5号Ab划线 |
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8号抗体标记的金垫 |
阳性 |
++ |
+ |
++ |
+ |
+ |
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阴性 |
+-- |
+-- |
+- |
+-- |
+- |
结论：经重复观察实验，以下四组单抗交叉配对效果较好。
2号抗体（3F10）标记配对3号抗体（4F4 ）划线
2号抗体（3F10）标记配对8号抗体（8株混合后）划线
3号抗体（4F4 ）标记配对4号抗体（5D2）划线
3号抗体（4F4 ）标记配对8号抗体（8株混合后）划线