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非洲猪瘟单抗制备及配对测试初步调试

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产品介绍

    非洲猪瘟单抗制备实验进程

    1、免疫时间计划表

    实验进程

    日期

    初免

    2021.03.26

    二免

    2021.04.02

    三免

    2021.04.09

    四免

    2021.04.16

    融合

    2021.04.19

    筛选

    2021.04.26

    亚一筛选

    2021.05.02

    亚二筛选

    2021.05.08

    亚三筛选

    2021.05.14

    腹水

    2021.05.23


    2、二免效价、抗体特异性

    加入免疫抗体100µL /孔， 轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应20min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。再加入酶标物100µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应20min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。加入底物液A液50µL/孔，再加底物显色液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。

    结果及结论见下表：


    Ag 500倍

    Ag 1k倍

    1-Ab 500倍

    4.71

    4.28

    1-Ab 5k倍

    3.58

    3.12

    2-Ab 500倍

    4.52

    3.97

    2-Ab 5k倍

    2.45

    2.01

    结论

    1、Ag包被浓度为3K倍。

    2、二免效价较高。

    3、筛选效价

    3.1 筛选效价

    加入酶标物50µL /孔， 再加入细胞上清50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。加入底物液A液50µL/孔，再加底物显色液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。结果见下图：




    结论：共选62个阳性孔的细胞进行抗体特异性测定。

    3.2 筛选抗体特异性

    加入酶标物50µL /孔， 再加入细胞上清50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。加入底物液A液50µL/孔，再加底物显色液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。结果见下图：







    结论：共选出14株效价高、抗体特异性好的细胞进行第一次亚克隆。

    株号有：2C4 3B9 3D6 3F10 4D1 4F4 5D2

    5D4 5D7 7D4 7D7 7C8 8G10 4F10

    4、亚一筛选效价

    加入酶标物50µL /孔， 再加入细胞上清50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。加入底物液A液50µL/孔，再加底物显色液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。


    结论：共选出10株效价高的细胞进行第二次亚克隆。

    株号有：2C4 3D6 3F10 4F4 5D2 5D4 5D7 7D4 8G10 4F10





    5、亚二筛选效价

    加入酶标物50µL /孔， 再加入细胞上清50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。加入底物液A液50µL/孔，再加底物显色液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。


    结论：经显微镜观察，有四株细胞100%纯阳性（5D2 5D4 5D7 3F10）扩大并冻存； 有六株细胞细胞进行第三次亚克隆。

    三次亚克隆株号有：2C4 3D6 4F4 7D4 8G10 4F10


    6、亚三筛选效价

    加入酶标物50µL /孔， 再加入细胞上清50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。加入底物液A液50µL/孔，再加底物显色液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。

    结论：经显微镜观察，有四株细胞100%纯阳性（8G10 2C4 4F4 7D4 ）扩大并冻存；

    4F10和3D6株细胞转阴性，扔之。


    7.腹水效价

    将筛选到的非洲猪瘟8株单抗，制备腹水并测腹水效价。

    加入酶标物50µL /孔， 再加入稀释后的抗体50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。加入底物液A液50µL/孔，再加底物显色液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。

    结果及结论见下表：

    细胞株

    Ab-5w

    Ab-10W

    效价

    2C4

    3.98

    3.17

    >10w

    3F10

    3.29

    1.63

    >10w

    4F4

    3.54

    1.55

    >10w

    5D2

    4.37

    2.11

    >10w

    5D4

    3.54

    1.62

    >10w

    5D7

    3.96

    1.91

    >10w

    7D4

    4.19

    2.54

    >10w

    8G10

    1.36

    0.84

    10w

    结论

    非洲猪瘟筛选到8株单克隆抗体，腹水效价10w以上。

    非洲猪瘟单抗配对初步测试

    ASFV共8株Ab，各按生产条件标记1条金垫后测试结果

    标记：1号.2C4 2号.3F10 3号.4F4 4号.5D2 5号.5D4  6号.7D4   7号.8G10   8号.混合 9号.兔多抗

    划线：用9株Ab同时划9种T线，1/1稀释.稀释液是动物CB液

    （一） 金垫标记：1-8号单抗；T线：兔多抗划线1:1（动物包被液稀释）；

    最初先用 1-8号金条和兔多抗1：1 划线测试阳性病料（1:5，用2*样稀稀释，非处理样品垫），如图1，8-10分观察，结论：爬速过快，需要调整爬速。

    结论如下表：



    1-8号金条与兔多抗1：1 测试阳性结果

    1号金垫

    2号金垫

    3号金垫

    4号金垫

    5号金垫

    6号金垫

    7号金垫

    8号金垫

    划线兔多抗1：1

    +

    +

    +-

    +

    ++

    -

    -

    +










    继续优化实验方案，用 1-8号金条和兔多抗1：1 分别测试阳性病料（1:5，用1*样稀稀释，用滤血膜）和猪阴性血清（1:5，用1*样稀稀释），8-10分观察，分别如图3和图4


    （二） 颠倒测试，金垫标记：9号兔多抗标记；T线：1，2，3,4,5,8号单抗1：1（动物包被液稀释）；

    阳性见图6，阴性见图7。  结论1,2号抗体最好。

    9号兔多抗标记金条与1，2，3,4,5,8号抗体划线测试阴阳性结果

    1号Ab划线

    2号Ab划线

    3号Ab划线

    4号Ab划线

    5号Ab划线

    8号Ab划线

    兔多抗标记的金垫

    阳性

    +

    +

    +

    +

    +

    +

    阴性

    +---

    +---

    +--

    +-

    +-

    +-


    （三） 对摸索到的六株单抗进行交叉配对测试（1号.2C4 2号.3F10 3号.4F4 4号.5D2 5号.5D4  8号.混合）

    （1）1号抗体标记金条，依次为2 3 4 5 8号抗体1：1划线，测试阳性（病料1:5稀释，用1*样稀），见图8.测试阴性（猪血清1:5，用1*样稀），结果见图9

    2号Ab划线

    3号Ab划线

    4号Ab划线

    5号Ab划线

    8号Ab划线

    1号抗体标记的金垫

    阳性

    +-

    +

    +

    +

    +

    阴性

    +--

    +-

    +--

    +--

    +--



    （2）2号抗体标记金条，依次为1 3 4 5 8号抗体1：1划线，测试阳性（病料1:5稀释，用1*样稀），见图10.测试阴性（猪血清1:5，用1*样稀），结果见图11

    1号Ab划线

    3号Ab划线

    4号Ab划线

    5号Ab划线

    8号Ab划线

    2号抗体标记的金垫

    阳性

    +

    ++

    +

    +

    ++

    阴性

    +--

    +-

    +--

    +--

    +-



    （3）3号抗体标记金条，依次为1 2 4 5 8号抗体1：1划线，测试阳性（病料1:5稀释，用1*样稀），见图12.测试阴性（猪血清1:5，用1*样稀），结果见图13

    1号Ab划线

    2号Ab划线

    4号Ab划线

    5号Ab划线

    8号Ab划线

    3号抗体标记的金垫

    阳性

    +

    +

    ++

    +

    ++

    阴性

    +--

    +--

    +--

    +--

    +-



    （4）4号抗体标记金条，依次为1 2 3 5 8号抗体1：1划线，测试阳性（病料1:5稀释，用1*样稀），见图14.测试阴性（猪血清1:5，用1*样稀），结果见图15

    1号Ab划线

    2号Ab划线

    3号Ab划线

    5号Ab划线

    8号Ab划线

    4号抗体标记的金垫

    阳性

    +

    +

    ++

    +

    +

    阴性

    +-

    +--

    +-

    +-

    +-




    （5）5号抗体标记金条，依次为1 2 3 4 8号抗体1：1划线，测试阳性（病料1:5稀释，用1*样稀），见图16.测试阴性（猪血清1:5，用1*样稀），结果见图17

    1号Ab划线

    3号Ab划线

    4号Ab划线

    5号Ab划线

    8号Ab划线

    2号抗体标记的金垫

    阳性

    +-

    ++

    +

    +

    ++

    阴性

    +--

    +--

    +-

    +--

    +-




    （6）8号抗体标记金条，依次为1 2 3 4 5号抗体1：1划线，测试阳性（病料1:5稀释，用1*样稀），见图18.测试阴性（猪血清1:5，用1*样稀），结果见图19

    1号Ab划线

    2号Ab划线

    3号Ab划线

    4号Ab划线

    5号Ab划线

    8号抗体标记的金垫

    阳性

    ++

    +

    ++

    +

    +

    阴性

    +--

    +--

    +-

    +--

    +-




    结论：经重复观察实验，以下四组单抗交叉配对效果较好。

    2号抗体（3F10）标记配对3号抗体（4F4 ）划线

    2号抗体（3F10）标记配对8号抗体（8株混合后）划线

    3号抗体（4F4 ）标记配对4号抗体（5D2）划线

    3号抗体（4F4 ）标记配对8号抗体（8株混合后）划线

【仅供科学研究使用】

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